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液相色譜柱的選擇、使用
點(diǎn)擊次數(shù):1112 發(fā)布時(shí)間:2018-07-30
液相色譜柱的選擇、使用
液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。本文重點(diǎn)介紹反相色譜柱的選擇和使用:
反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
反相柱點(diǎn)是固定相穩(wěn)定,應(yīng)用,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動(dòng)相的PH值小于2時(shí),會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況,色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。
2.填料的端基封尾(或稱封口)
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾,可改善對(duì)性化合物的吸附或拖尾;含碳量增了,有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了,組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。
液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前,進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是*條件),只有這樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn):
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí),分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
a.含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。加入*,防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
b.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
c.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相,使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,提柱性能。
液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。本文重點(diǎn)介紹反相色譜柱的選擇和使用:
反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
反相柱點(diǎn)是固定相穩(wěn)定,應(yīng)用,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動(dòng)相的PH值小于2時(shí),會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況,色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。
2.填料的端基封尾(或稱封口)
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾,可改善對(duì)性化合物的吸附或拖尾;含碳量增了,有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了,組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。
液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前,進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是*條件),只有這樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn):
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí),分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
a.含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。加入*,防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
b.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
c.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相,使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,提柱性能。
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